Artigo Original
-
Ano 2017 -
Volume 7 -
Supl.1
Utilização de biomarcadores na tuberculose pediátrica
Use of biomarkers in pediatric tuberculosis
Utilización de biomarcadores en tuberculosis pediátrica
Christiane Mello Schmidt1; Adriano Queiroz2; Claudete Aparecida Araújo Cardoso3
RESUMO
No presente artigo são revisados o conceito de biomarcadores e biosignature e o seu potencial uso na tuberculose pediátrica, com aplicação no desenvolvimento de novas vacinas e de novos métodos laboratoriais que permitam o diagnóstico mais preciso e a avaliação da resposta ao tratamento. Enfatizam-se, também, os métodos que incluem a dosagem de anticorpos, citocinas, transcriptomas, proteomas e metabolomas.
Palavras-chave:
biomarcadores farmacológicos, tuberculose, criança.
ABSTRACT
In this article, we review the concept of biomarkers and biosignature and their potential use in pediatric tuberculosis, with application in the development of new vaccines and new laboratory methods that allow a more accurate diagnosis and evaluation of the response to treatment. Emphasis is also given to methods which include the dosage of antibodies, cytokines, transcriptomics, proteomics and metabolomics.
Keywords:
biomarkers, pharmacological, tuberculosis, child.
RESUMEN
En el presente artículo son revisados el concepto de biomarcadores y biofirma (biosignature) y su potencial uso en la tuberculosis pediátrica, con aplicación en el desarrollo de nuevas vacunas y de nuevos métodos de laboratorios que permiten el diagnóstico más preciso y la evaluación de la respuesta al tratamiento. Se enfatizan también los métodos que incluyen la dosificación de anticuerpos, citocinas, transcriptomas, proteomas y metabolomas.
Palabras-clave:
Biomarcadores Farmacológicos, Tuberculosis, Niño.
INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB), cujo agente etiológico identificado em 1882 é o Mycobacterium tuberculosis, ainda representa um desafio para a saúde pública no mundo1,2. As dificuldades para o melhor controle dessa doença estão relacionadas à pobreza, ao retardo no diagnóstico de casos com TB ativa, à falta de adesão ao tratamento, à infecção por cepas resistentes, à coinfecção pelo HIV, ao controle inadequado dos contactantes e o não tratamento dos casos de infecção latente pela TB (ILTB)1.
Do ponto de vista pediátrico, o diagnóstico da TB pulmonar se constitui um desafio na prática clínica, uma vez que as crianças podem apresentar-se com sinais, sintomas clínicos e alterações radiológicas inespecíficas. Nesta faixa etária, as lesões secundárias a TB comumente são paucibacilares, tornando o isolamento da bactéria difícil. Soma-se a esse isolamento difícil o fato de as crianças não conseguirem expectorar. Ademais, o risco de adoecimento é maior nos dois primeiros anos de infecção e as crianças menores de 5 anos são mais susceptíveis a desenvolver formas graves da doença3.
A TB nas crianças pode ser classificada como TB confirmada, TB não confirmada e TB improvável. A TB confirmada é aquela em que o resultado da cultura para o M. tuberculosis e/ou do teste rápido molecular para pesquisa do DNA bacteriano foram positivos. Na TB não confirmada, não houve confirmação bacteriológica e os indivíduos tiveram ao menos dois dos seguintes achados: sintomas ou a radiografia de tórax com achados sugestivos de TB, história de contato para TB, evidência ou não de infecção pelo M. tuberculosis e adequada resposta ao tratamento específico. Entende-se por evidência de infecção para a TB, o resultado positivo da prova tuberculínica e/ou a dosagem de interferon gama (Igras). Nos casos de TB improvável, os pacientes não tiveram confirmação bacteriológica nem preencheram os critérios para TB não confirmada4.
Esta classificação, recentemente proposta por Graham et al.4, inclusive para uniformização da classificação dos casos em estudos com TB pediátrica, demonstra a dificuldade que ainda temos na definição desses casos e como novos métodos diagnósticos podem contribuir para confirmar os casos de TB com bacteriologia negativa, evitando assim o tratamento desnecessário desses pacientes. Da mesma forma, o controle laboratorial da resposta ao tratamento nos pacientes com TB não confirmada ou improvável apresenta limitações. Os casos de TB extrapulmonar também costumam ser paucibacilares5. Estas situações em que não há confirmação bacteriológica constituem ainda um desafio na prática clínica pediátrica.
Até o momento, distinguir entre ILTB e TB ativa pode ser difícil e os métodos laboratoriais disponíveis como o teste tuberculínico e a dosagem de interferon gama não permitem esta diferenciação6. Discriminar essas duas situações é fundamental. Primeiro, o diagnóstico de ILTB, em que o paciente está infectado e não apresenta sinais e sintomas de TB pulmonar ou extrapulmonar, permite o uso de apenas um fármaco, a isoniazida, por seis meses, conforme indicado atualmente pelo Ministério da Saúde7.
Tal medida diminui o risco de adoecimento do paciente. Além disso, a dificuldade em discriminar as duas situações pode levar ao tratamento equivocado de um caso de ILTB com três ou quatro medicamentos, dependendo da idade do paciente e também o uso de monoterapia, com isoniazida para casos de TB ativa. Ambos os tratamentos, quando realizados de maneira equivocada, contribuem para a elevação da morbidade da população afetada.
Ainda hoje, a vacina BCG, disponível para uso em dose única nas crianças ao nascimento, protege apenas contra as formas disseminadas da doença (TB miliar e meningoencefalite tuberculosa), com uma proteção que não ultrapassa 80%8.
Nesse contexto, o melhor conhecimento das características biológicas do agente etiológico, bem como a sua interação com o hospedeiro por meio da mensuração de biomarcadores, podem promover o desenvolvimento de novos métodos laboratoriais que possam contribuir na resposta a esses desafios e, consequentemente, no melhor controle da doença.
BIOMARCADORES E BIOASSINATURA: DEFINIÇÃO
Os biomarcadores são definidos como moléculas que têm a característica de medir e expressar um processo biológico normal, um processo patogênico e também a resposta terapêutica à intervenção farmacológica9,10. O biomarcador pode ser originário do patógeno ou do hospedeiro, podendo ser detectado através de uma única medida em uma amostra ou através de um estímulo, in vivo ou in vitro. Quando característico de uma doença, o biomarcador ou a biosignature tem a possibilidade de ser utilizado como teste diagnóstico9.
A bioassinatura é definida como um “set” ou conjunto de biomarcadores.
Em uma doença tão complexa como a TB, que ainda apresenta tantos desafios, a dosagem de vários ao invés de um biomarcador parece ser mais eficaz na tentativa de elucidá-los11.
BIOMARCADORES NA TUBERCULOSE: POTENCIAIS DE APLICABILIDADE NA PRÁTICA CLÍNICA PEDIÁTRICA
A descoberta de novos biomarcadores abre uma perspectiva para a sua utilização em diferentes situações clínicas de desafio enfrentadas para o melhor controle da TB.
Algumas características são importantes para um bom biomarcador: diferenciar indivíduos saudáveis e com TB ativa, normalizar com o tratamento e ser reprodutível em diferentes populações com relação ao desfecho clínico10. Outro aspecto interessante relativo aos biomarcadores é a possibilidade de ser mensurado em outros espécimes clínicos tais como sangue, urina e ar exalado, dentre outros12.
O desenvolvimento de pequenos dispositivos portáteis - um teste point of care - para a dosagem de biomarcadores, em amostras que não o escarro - é uma necessidade para o atendimento inicial dos pacientes com suspeita de TB. Como nas crianças e nos pacientes com coinfecção TB/HIV a qualidade do escarro coletado é prejudicada e a sensibilidade da baciloscopia é baixa, um teste rápido com potencial de ser realizado em outras amostras e que apresente moderada a elevada sensibilidade e alta especificidade pode ser de grande utilidade2.
Ainda sob o ponto de vista de diagnóstico, seria interessante um marcador que indicasse aqueles indivíduos com maior risco de adoecimento ou de evolução de ILTB para TB ativa13.
Com relação ao tratamento, os biomarcadores podem ser úteis na detecção de casos com possibilidade de receber esquemas terapêuticos de menor duração, prever o risco de recaída e também avaliar a resposta ao tratamento9.
Para o desenvolvimento de novas vacinas, os biomarcadores têm o potencial de identificar moléculas mais imunogênicas, quantificar a reatividade de células T aos antígenos vacinais e determinar a durabilidade desta resposta em relação à dose da vacina e quanto ao uso ou não de adjuvante13.
A INTERAÇÃO DO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COM O HOSPEDEIRO
A infecção pelo M. tuberculolosis desencadeia resposta imune humoral, com a síntese de anticorpos de vários isotipos (IgA, IgM e IgG) contra os antígenos das micobactérias e também a resposta imune celular, com ativação de monócitos, macrófagos e linfócitos11. Assim, tanto a dosagem de anticorpos específicos como de produtos liberados por células ativadas - enzimas, citocinas, transcriptomas, proteomas e metabolomas - têm o potencial de serem biomarcadores úteis no melhor conhecimento do agente etiológico e de sua interação com o hospedeiro.
Sabe-se que existe uma complexa interação entre a epidemiologia, o agente infeccioso e o hospedeiro com relação ao desenvolvimento da doença. Tal complexidade de interação se justifica pelo fato de que a resposta a um agravo infeccioso depende de múltiplos fatores. O grande desafio se constitui em definir um biomarcador que reflita essa interação e se constitua uma ferramenta que poderá potencialmente desempenhar um papel relevante ao diferenciar as crianças saudáveis daquelas com TB ativa, além de retornar aos níveis normais com a instituição da terapêutica e ser replicável em outras populações.
DOSAGEM DE ANTICORPOS CONTRA ANTÍGENOS DO MYCOBATERIUM TUBERCULOSIS
A dosagem sérica de anticorpos específicos nos casos de TB pediátrica é instigante, visto que esta análise não precisa de coleta de material do sítio de infecção e pode ser mensurada de forma rápida e com relativo baixo custo, utilizando dispositivos simples14,15.
Na infância, ao avaliarmos os testes diagnósticos envolvendo a dosagem de imunoglobulinas, é necessário considerar alguns aspectos do sistema imune neste grupo etário. Nos lactentes e nas crianças menores, o sistema imune ainda está em desenvolvimento. Os recém-nascidos inicialmente respondem aos antígenos com maior síntese de IgM. A proteção pela IgG se dá principalmente pela passagem deste isotipo a partir da placenta e a IgA é fornecida principalmente pelo leite materno16,17. Os níveis das imunoglobulinas IgM, IgG e IgA atingem valores próximos aos adultos aos 2, 6 e 10 anos, respectivamente18. Vários estudos referentes ao uso da sorologia como método diagnóstico na TB foram realizados em adultos. Achkar & Ziegenbalg15 realizaram uma revisão sobre o tema em Pediatria e encontraram 23 artigos. Nesta revisão, foram encontradas grandes variações entre os níveis de anticorpos; a sensibilidade variou de 14 a 85% e a especificidade de 86 a 100%.
Os autores destacam dificuldades em comparar os resultados entre esses estudos devido a diferenças na metodologia entre eles, tais como: idade dos pacientes, antígenos distintos (Ag5, “old tuberculina”, A60 (ANDA-TB) 16KDA, 30 KDA, 38 KDA, PPD, ESAT-6, TBLG, LOS, DAT, PGBTb1,complexo Ag 85 e CFP 10), isotipo avaliado (IgM, IgG, IgA e IgE), isolados ou combinados, uso de kits comerciais ou métodos in house e tipo de TB apresentada pelos pacientes nas pesquisas (confirmada, não confirmada e improvável)4,15.
Quanto ao tipo de TB, estudos avaliando a sorologia demonstram que nos pacientes com lesões cavitárias, e consequentemente maior carga bacilar, o nível de anticorpos é maior provavelmente devido a maior estímulo antigênico e maior resposta inflamatória19,20. Ressalta-se que as lesões cavitárias são achados menos frequentes nos casos de TB pulmonar em crianças quando comparadas com adolescentes e adultos21.
Outro aspecto a ser considerado em relação ao uso deste método em TB pediátrica é a relação dos níveis de anticorpos antiantígenos das micobactérias e a vacinação prévia com BCG. Estes anticorpos são influenciados pela idade da criança, tempo de vacinação com BCG, antígeno e isotipo testado15. Alguns estudos encontraram níveis mais elevados para determinado antígeno quando comparadas crianças vacinadas e não vacinadas22. No entanto, de uma forma geral, diversos autores mostraram que a história prévia de vacinação BCG não influencia os níveis de anticorpos para diferentes antígenos testados15.
Atualmente, a Organização Mundial de Saúde (OMS) não recomenda a utilização de testes sorológicos para o diagnóstico de TB nas diversas faixas etárias23.
CITOCINAS
As citocinas, secretadas pelas células ativadas por antígenos do M. tuberculosis, têm potencial para serem utilizadas como biomarcadores em TB, especialmente na distinção entre ILTB, TB ativa e outras doenças pulmonares. Para serem potenciais biomarcadores, as moléculas avaliadas devem apresentar algumas características como: estarem “upregulated” nos casos de TB ativa quando comparadas com indivíduos com ILTB e saudáveis, e serem secretadas pelas células estimuladas especificamente por antígenos específicos do M. tuberculosis. Algumas citocinas podem ser liberadas por macrófagos e células T inespecíficas e apresentarem-se elevadas em várias doenças. Estas citocinas já foram detectadas em níveis elevados em pacientes com TB: I-309, CXCL9, IL-10, IL-6, IL-7, IL-8, G-CSF, TGF-β1, CCL2, IL2, IL13 e TNF-F α24.
A dosagem de IP-10 (interferon gamma inducible protein 10) tem sido avaliada em pesquisas relacionadas à TB pediátrica. Jenum et al.25 encontraram resultados promissores avaliando crianças na Índia, quando associaram a análise desta citocina ao interferon gama.
A comparação entre os resultados dos estudos avaliando citocinas em TB pode ser difícil, pois há diferença entre as citocinas e os métodos utilizados para identificá-las24.
A dosagem da citocina interferon-gama (Igras) está disponível comercialmente para uso na prática clínica. Tem a vantagem de não sofrer a interferência da vacinação BCG nem ao contato prévio com outras micobactérias. No entanto, esse método laboratorial não permite a diferenciação entre ILTB e TB ativa. Em crianças menores de 2 anos este método apresenta limitações6. No Brasil, não está disponível para uso nas unidades públicas de saúde.
TRANSCRIPTOMAS
A leitura de parte do DNA resulta em moléculas de RNA -os transcriptos. A coleção de transcriptos é denominada transcriptoma. A avaliação dos transcriptomas permite analisar em uma célula quais gens estão ou não ativados nas diversas circunstâncias. A maioria dos transcriptos é formada de RNA mensageiro que está diretamente relacionado à síntese de proteínas26.
Um estudo prospectivo, realizado em crianças com suspeita de TB, infectadas ou não pelo HIV, na África do Sul, Malawi e Quênia, identificou uma assinatura de 51 transcriptos, que possibilitou a diferenciação entre TB e outras doenças. A sensibilidade foi de 82,9% e a especificidade de 83,6%, para o diagnóstico nos pacientes com TB confirmada por cultura. A sensibilidade foi de 62,5 a 82,3%, 42,1% a 80,8% e 35,3 a 79,6%, respectivamente, nas crianças com TB altamente provável, provável ou possível respectivamente, mas com a cultura negativa27.
PROTEOMAS
O conjunto de proteínas expresso por determinada célula, nas diversas situações, denomina-se proteoma. Inicialmente, proteínas do M. tuberculosis foram identificadas por meio de métodos imunológicos e bioquímicos. A partir dos anos 90, novas tecnologias como a eletroforese 2-D e a espectrometria de massa vêm permitindo a identificação de diversas proteínas desse microorganismo28.
A análise de diferentes componentes celulares pode identificar marcadores imunogênicos, de virulência, de estado de latência ou atividade, que podem ter utilidade no desenvolvimento de novas vacinas, drogas e ferramentas para um diagnóstico mais preciso da TB28.
Alguns exemplos de proteínas, entre outras, já isoladas: Rv0899, que permite a sobrevivência da bactéria em pH baixo, Rv2246, envolvida na síntese de ácido micólico presente na parede celular do M. tuberculosis e patogênese e Rv2873, uma lipoproteína presente em maior quantidade no M. bovis do que no M. tuberculosis28-31.
METABOLOMAS
A metabolômica é o estudo do repertório de metabólitos de uma célula, órgão ou organismo. Assim como as outras “ômicas”, a metabolômica é uma ferramenta de larga escala, mas tem a vantagem de prover o retrato de um organismo em um determinado instante. Sua capacidade de detecção está limitada a moléculas de tamanhos reduzidos, cuja massa atômica é menor que 3.000. Steve Oliver, da Universidade de Manchester, descreveu a metabolômica como: “um grupo de metabólitos de baixo peso molecular, que são dependentes do contexto ao qual estes metabólitos estão inseridos e que variam de acordo com a fisiologia e estado patológico ou de desenvolvimento da célula, tecido, órgão ou organismo32.
Na análise metabolômica são estudados uma grande variedade de compostos químicos, incluindo: açúcares, aminoácidos, esteroides, ácidos graxos, fosfolipídios e ácidos orgânicos. Esses metabólitos podem ser divididos com base na solubilidade em soluções aquosas. Os métodos de metabolômica convencional têm enfatizado no estudo de extratos de moléculas solúveis em água, encontradas no citoplasma celular. Compostos hidrofóbicos como os ácidos graxos e colesterol são normalmente encontrados na superfície celular e são objetos de estudo de uma subespecialidade da metabolômica, a lipidômica33.
Um fator do M. tuberculosis que pode ser explorado para o desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas é a parede celular. Cerca de 40% do peso seco da parede celular do M. tuberculosis é composto de lipídios e um terço do seu genoma é devotado à biossíntese e metabolismo de lipídios33-35. Uma análise de lipidômica recente mostrou que o M. tuberculosis contém cerca de 5.000 espécies lipídicas33.
O M. tuberculosis constantemente remodela o conteúdo de lipídios da parede celular em resposta às condições estressantes impostas pela resposta imune do hospedeiro35. Mudanças na composição lipídica da parede celular resultam em uma maior concentração de lipídios menos imunogênicos na parede celular, o que parece contribuir para que o M. tuberculosis estabeleça uma infecção de longo prazo35,36.
Outro mecanismo observado durante a infecção e que também é dependente dos lipídios do M. tuberculosis é a alteração da homeostase lipídica nas células do hospedeiro. Alguns lipídios do M. tuberculosis são capazes de estimular o acúmulo de gotas de lipídios contendo colesterol, triacilglicerol e fosfolipídios, resultando na formação dos macrófagos espumosos. Essa condição parece criar um ambiente propício à sobrevivência do M. tuberculosis no meio intracelular37.
A metabolômica e a lipidômica podem detectar os subprodutos do metabolismo bacteriano e as alterações metabólicas ocorridas no hospedeiro. Essas informações podem ser usadas na identificação de biomarcadores para a TB. Em um estudo piloto, Frediani et al.38 realizaram uma análise de metabolômica em plasma de indivíduos diagnosticados com TB ativa e nos comunicantes saudáveis.
Nesse estudo os autores identificaram diversos metabólitos que se mostraram quantitativamente distintos entre esses dois grupos. A identificação putativa desses metabólitos revelou, por exemplo, o aumento do aminoácido glutamina, do glicolipídio de parede celular do M. tuberculosis, trealose-6-mycolato, e de uma resolvina da série D, nos indivíduos infectados38.
Em um outro estudo, a análise de metabolômica identificou 20 metabólitos que permitiram, consistentemente, distinguir indivíduos com TB ativa e latente. Além de prover biomarcadores metabólitos para TB, essa ferramenta também mostrou que a infecção pelo M. tuberculosis altera metabólitos associados à anti-inflamação, imunossupressão e estresse39.
É possível que as alterações lipídicas ocorridas no hospedeiro e decorrentes da infecção pelo M. tuberculosis possam ser detectadas a partir da análise de lipidômica no soro ou plasma dos pacientes com TB. A detecção do glicolipídio do M. tuberculosis trealose-6-mycolato em pacientes com TB (Frediani et al.38) cria a perspectiva de que: 1 - novas ferramentas diagnósticas baseadas na detecção de compostos lipídicos do M. tuberculosis sejam desenvolvidas e 2 - outros lipídios da parede celular do M. tuberculosis sejam identificados no soro de pacientes com TB e permitam uma melhor compreensão das alterações lipídicas do M. tuberculosis durante a infecção.
Em conjunto, as modificações da composição lipídica da parede celular do M. tuberculosis e as alterações na homeostase lipídica no hospedeiro durante a TB podem ser detectadas pelas análises de lipidômica. Essas informações podem ser úteis para a identificação de potenciais biomarcadores capazes de prever a progressão da TB latente para a doença ativa38.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em uma doença tão complexa como a TB, a descoberta de novos biomarcadores pode contribuir para melhor compreensão e potencial resolução de desafios relacionados à prevenção, ao diagnóstico (fundamental em crianças) ao tratamento e ao desfecho clínico. O manuseio adequado de tal agravo de saúde na faixa etária pediátrica poderá resultar em menor morbimortalidade da população acometida pela doença.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Clemax Couto Sant’Anna (UFRJ), nossa referência de pesquisador em TB pediátrica, por toda a sua contribuição em nossa pesquisa em biomarcadores na tuberculose em crianças e adolescentes.
Ao Prof. Lee Riley (Universidade da Califórnia, Berkeley), pelo exemplo de rigor acadêmico e por todo o incentivo e apoio à pesquisa de biomarcadores em tuberculose realizada pelo grupo de Estudos em Tuberculose Pediátrica na Universidade Federal Fluminense.
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1. Mestrado em Saúde da Criança e do Adolescente - Professora Assistente em Pediatria do Departamento Materno Infantil da Faculdade de Medicina da Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil
2. Pós-Doutorado em Saúde Pública - Pesquisador do Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz/FIOCRUZ - CPQGM/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
3. Pós-doutorado em Saúde Pública - Professora Adjunta em Pediatria do Departamento Materno Infantil da Faculdade de Medicina da Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil
Endereço para correspondência:
Claudete Aparecida Araújo Cardoso
Universidade Federal Fluminense
Av. Marquês do Paraná, nº 303, Centro
Niterói - RJ. Brasil. CEP: 24033-900
E-mail: claudetecardoso@id.uff.br
Data de Submissão: 30/03/2017
Data de Aprovação: 25/04/2017
